Определение активности ферментов с целью диагностики болезней

Наступающие изменения активности ферментов в сыворотке крови, клеточном соке или моче могут использоваться для диагностики целого ряда заболеваний. На рис 2-16 показаны возможные причины ведущие к появлению тканевых ферментов в крови или моче

Рис 2-18. Причины появления и источники тканевых ферментов в плазме крови

Энзимодиагностика может быть эффективной в двух основных группах заболеваний:

• заболевания, которые связаны с нарушением функции или гибелью клеток,
• заболевания, при которых нарушается выделение (секреция) фермента.

В случае, если заболевание связано с повреждением клеток, начиная с ограничения функций мембран до тяжелейших повреждений органелл или всей клетки (некроз), то из клеток и поврежден­ных органелл специфические ферменты поступают через капилляры и лимфу в общий кровоток. Тогда их активность можно определять в крови. Если при заболевании заблокированы пу­ти выведения ферментов, то такие ферменты накапливаются сначала в клетках и органах, где они синтезируются, и затем могут проникать в кровь. В норме активность таких ферментов в крови незначительна. Поэтому всякое повышение ее наводит на мысль о повреждении. Все вышесказанное позволяет выделить две группы ферментов, важные с точки зрения диагностики заболеваний:

-клеточные ферменты,

-секретируемые ферменты.

Под секретируемыми понимают такие ферменты, которые образуются в оп­ределенных органах, и затем выделяются из них в кровь, желчь и/или в кишечник, где они выполняют свои функции. Типичным примером являются ферменты, принимаю­щие участие в переваривании пищи (липаза, амилаза), которые образуются поджелудоч­ной железой и выделяются в просвет кишечника. Аналогично, ферменты, катализирую­щие процессы свертывания крови, образуются в печени и выделяются в плазму крови. Острое воспаление поджелудочной железы может привести к тому, что ферменты, катали­зирующие в норме переваривание компонентов пищи, через поврежденные воспалением капилляры могут попасть в кровь. С другой стороны, перекрытие, в силу различных при­чин, просвета ходов, связывающих поджелудочную железу с кишечником, может сопро­вождаться возвратом ферментов в железу и уменьшением их поступления в кишечник. Хронические заболевания различных органов зачастую сопровождаются нарушением в них биосинтетических процессов. Вследствие этого снижается активность секреторных ферментов в местах их действия. Учитывая органную специфичность секретируемых ферментов, определение их активности в ряде случаев помогает в диагностике органной локализации заболеваний. В случае определения активности клеточных ферментов имеет­ся сложность в интерпретации полученных результатов. Она вызвана низкой их специ­фичностью, поскольку эти ферменты есть в каждом органе. Этот недостаток может быть устранен при определении изоферментов, которые имеют большую органоспецифично-

сть. В качестве примера можно привести определение активности изоферментов лактатде-

Рис 2-19.Изменения активности КФК (креатинфосфокиназы), АсАТ (аспарагиновая трансаминаза), ЛДГ (лактатдегидрогеназы), ГБДГ (гидроксибутират дегидрогеназы) у больного инфарктом миокарда в разные сроки после начала заболевания.

гидрогензы (ЛДГ). Повышение активности ЛДГ в крови указывает на поражение сердеч­ной мышцы, а увеличение — ЛДГ5 без существенного повышения ЛДГ, свидетельствует о поражении клеток печени. Повысить диагностическую ценность помогает также парал­лельное определение активности нескольких клеточных ферментов с последующим под­счетом их соотношения. Дело в том, что спектр активности клеточных ферментов в крови зависит от рода и места заболевания. Измерение активности ферментов имеет значение не только для постановки диагноза и ранней диагностики (к примеру, при инфекционном ге­патите оно проявляется уже в день появления клинических симптомов).

Повторное иссле­дование активности в процессе болезни позволяет следить за ходом патологического про­цесса и прогнозировать исход заболевания. При инфаркте миокарда вероятность возникновения рецидивов можно установить не только с помощью ЭКГ, но и используя определение активности ферментов.

Энзимодиагностические тесты при гепатитах, позволяют предсказать превраще­ние острых проявлений заболеваний в хронические, как и появление клинически бессим­птомных рецидивов.

При определении активности ферментов в сыворотке крови исключительное значение имеет время исследования, так как повышение активности в сыворотке происходит только в тот период развития заболевания, когда фермент появляется в крови. Обычно происхо­дит быстрое повышение активности и медленное возвращение ее к норме. На ри­сунке 2-19 показаны результаты наблюдения за активностью ферментов у больного инфарктом миокарда. Естественно, в данном раз­деле невозможно перечислить все возможности и особенности энзимной диагностики. Здесь упомянуты лишь принципиальные положения этого метода. При последующем об­суждении процессов обмена веществ, представления об энзимодиагностике будут расши­рены. В таб. 2-4 приведена информация об отдельных ферментах, которые нашли применение в медицинской практике.

Энзимодиагностика. Происхождение ферментов плазмы крови.

Ферменты, плазмы крови, делятся на две группы:

1 — выполняющие специализированные функции в крови. К ним относятся:

а) ферменты системы свертывания крови,

б) ферменты, функционирующие в системе комплемента или

в) участвующие в растворении внутрисосудистых сгустков крови.

2 — ферменты, в норме выполняющими определенные функции внутри клеток (амилаза, лактатдегидрогеназа, глутамилтранспептидаза и др.) или являющихся секреторными веществами (ферменты желудочно-кишечного тракта) и не вы­полняющими метаболических функций в плазме. Они освобождаются из клеток крови и других тканей в результате естественного лизиса последних или при не­которых патологических состояниях.

Энзимодиагностика — определение активности ферментов в биологических жидкостях (плазме крови, моче, секретах пищеварительного тракта) для поста­новки диагноза заболевания. Для диагностики в клинике исследуют ферменты второй группы. В норме их активность в плазме незначительна, но увеличивает­ся при повреждении ткани — источника ферментов, или в) при избыточной клеточной пролиферации (в период активного роста костей, особенно у детей и подростков, уровень щелочной фосфатазы повышен, увеличивается активность ряда ферментов и при онкопролиферативных процессах).

Определение ферментов в плазме крови с целью диагностики заболеваний

Ферменты плазмы крови, используемые для диагностики болезней, часто про­дуцируются несколькими органами или тканями, что ограничивает их диагно­стическую специфичность. Для повышения специфичности энзимологических исследований определяют изоферменты, которые, как правило, органоспецифичны. Полученные результаты интерпретируют в свете клинической картины.

Основные ферменты, определяемые в плазме при диагностике болезней.

Аспартатаминотрансфераза -клинически значимое увеличение активности на­блюдаются при заболеваниях сердца (инфаркт миокарда), скелетных мышц (травмы, миопатии).

Аланинаминотрансфераза — патологическое увеличение активности — при ост­рых гепатитах, циррозах печени.

гамма-Глутамилтрансфераза — наибольшее диагностическое значение изменения активности — в диагностике гепатобиллиарного тракта; активность фермента по­вышается у пациентов, злоупотребляющих алкоголем, особенно при алкоголь­ных заболеваниях печени; чувствительный показатель холестаза.

альфа-Амилаза -клиническое значение определения активности амилазы в сыворот­ке крови состоит в том, что присутствие этого фермента является маркером:

— почечной недостаточности (при более чем 5-кратном превышении активности)

— острого панкреатита (при 10-кратном преышении уровня уровня сывороточной амилазы).

Обнаружение в крови только панкреатической альфа-амилазы служит чувствитель­ным и специфичным тестом для диагностики панкреатита.

Креатинкиназа — исследование активности проводят при заболеваниях мышц, когда основным изоферментом в сыворотке крови является ММ (мышечный), и при инфаркте миокарда, когда доминирует изофермент MB (гибридный).

Кислая фосфатаза, основной ее источник — предстательная железа, хотя значи­тельные количества найдены в эритроцитах, печени, селезенке, тромбоцитах, диагностические измерения активности используются для мониторинга мета­статической карциномы простаты (увеличивается у 80% пациентов с этим забо­леванием);

ткань — источник фермента идентифицируется с помощью ингибиторов фер­мента (тартрат ингибирует простатический изофермент, а формальдегид ингибирует изоферменты из других тканей).

Щелочная фосфатаза, катализирует гидролиз эфиров фосфорной кислоты, патологическое увеличение активности — при заболевания гепатобилиарного де­рева (холестаз, обтаруционная желтуха, цирроз, гепатиты) и костей (гиперпара-тиреоидизм, остеомаляция и др.); активность фермента определяют у недоно­шенных детей с цель ранней диагностики рахита;

ткань — источник фермента идентифицируется определением изоферментов ще­лочной фосфатазы (печеночный, костный, плацентарный, зародышевый кишеч­ный, текстикулярный).

Лактатдегидрогеназа -катализирующая превращение пирувата в лактат, при­сутствует в большинстве тканей, поэтому измерение ее общей активности низ­коспецифично. Диагностическую ценность представляет определение ее изоферментов.

ЛДГ1-инфаркт миокарда, ЛДГ2-острый лимфобластный лейкоз, ЛДГ3-доброкачественные опухоли женских половых органов, ЛДГ4-поражения печени, ЛДГ5-острая фаза ревматизма, кардиосклероз, поражение почек.

Определение изоформы лактатдегидрогеназы — ЛДГ1, позволяет достоверно ди­агностировать инфаркт миокарда. Диагностически значимым является двукрат­ное превышение уровня этого изофермента по сравнению с нормой.

Date: 2016-05-24; view: 2986; Нарушение авторских прав

1. Широкое применение в медицинской практике ферменты находят в качестве диагностических (энзимодиагностика)и терапевтических (энзимотерапия)средств. Ферменты также используются в качестве специфических реактивовдля определения ряда метаболитов. Например, фермент глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови; фермент уреазу используют для оценки содержания в биологических жидкостях мочевины; с помощью различных дегидрогеназ выявляют наличие соответствующих субстратов, например пирувата, лактата, этилового спирта и т.д.

2. Энзимодиагностиказаключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека.

Важная особенность ферментов, используемых в диагностике, состоит в том, что можно определить активность каждого из них в природном биоматериале без предварительного фракционирования: в крови, моче, спинномозговой жидкости, слюне, желудочном и кишечном соке и др.

К ферментам, используемым в энзимодиагностике, предъявляют следующие требования:

• органоспецифичность (тканеспецифичность) фермента;

• выход фермента в кровь при повреждении органа или ткани;

• низкая активность фермента в крови в норме.

При этом условно различают:

• Неспецифические ферменты, которые присутствуют во всех тканях в разных количествах;

• тканеспецифические ферменты, присутствующие только в данной конкретной ткани.

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но с разной первичной структурой белка, называют изоферментами.Они отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты или их субъединицы. На различиях в физико-химических свойствах и основаны методы определения изоферментов. Изоферменты часто являются органоспецифичными,так как в каждой ткани содержится преимущественно один тип изоферментов. Следовательно, при повреждении органа в крови появляется соответствующая форма изофермента. Обнаружение определенных изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ)катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты) (рис. 2.31). Лактатдегидрогеназа — олигомерный белок с мол. массой 134 000, состоящий из четырех субъединиц двух типов — М (от англ. muscle — мышца) и Н (от англ. heart — сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования пяти изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2.32, А). Активная ЛДГ представляет собой одну из комбинаций:

Н4 (изоформа ЛДГ1);

Н3М (изоформа ЛДГ2);

Н2М2 (изоформа ЛДГ3);

НМ3 (изоформа ЛДГ4);

М4 (изоформа ЛДГ5).

ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5- в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются другие варианты этого фермента. Изоформы ЛДГ различаются по молекулярной массе, заряду, электрофоретической подвижности, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ (рис. 2.32, Б). Для диагностики заболеваний сердца печени и мышц необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза. На рис. 2.32, В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифических изоформ ЛДГ широко используется в качестве диагностического теста. При поражении печени в крови повышается активность ЛДГ5, а при инфаркте миокарда — ЛДГ1.

Другим примером может служить креатинкиназа. Креатинкиназа (КК)которая катализирует реакцию образования креатинфосфата (рис. 2.33). Молекула КК представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов М (от англ. muscle — мышца) и В (от англ. brain — мозг). Эти субъединицы образуют три изофермента: ВВ, МВ, ММ. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ — в скелетных мышцах и МВ — в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность (рис. 2.34). Определение активности КК в плазме крови имеет значение при диагностике инфаркта миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

Рис. 2.31. Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой (ЛДГ)

Рис. 2.32. Изоформы лактатдегидрогеназы:

А — строение различных изоформ ЛДГ; Б — распределения на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах; В — содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы — слева и фотометрическое сканирование — справа)

Рис. 2.33. Реакция, катализируемая ферментом креатинкиназа (КК)

Рис. 2.34. Структура и электрофоретическая подвижность различных изоформ креатинкиназы

При карциноме простаты, патологии костной ткани, метастатических карциномах определяют активность кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы и некоторых других органоспецифических ферментов в сыворотке крови.

• Энзимодиагностикаиспользуется для установления диагноза при заболеваниях различных органов. Набор анализов зависит от возможностей конкретной биохимической лаборатории и постоянно совершенствуется. Наиболее распространены следующие энзимодиагностические тесты:

— при заболеваниях сердца (инфаркт миокарда) — лактадегидрогеназа, креатинкиназа, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза. Одним из первых белков при инфаркте миокарда в крови появляется белок — тропонин;

— при заболеваниях печени — аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, ацетилхолинэстераза, гамма-глутамилтранспептидаза. При заболеваниях поджелудочной железы — панкреатическая амилаза, липаза;

— при заболеваниях простаты — кислая фосфатаза.

3. Применение ферментов в качестве лекарственных препаратовактивно развивают в следующих направлениях:

• заместительная терапия — использование ферментов в случае их недостаточности;

• элементы комплексной терапии — применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Сейчас ферментативные препараты применяются в хирургии, терапии, акушерстве и гинекологии, урологии, стоматологии, отоларингологии и многих других областях медицины.

Заместительную энзимотерапию проводят при отсутствии ферментов в организме (наследственном или приобретенном). Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при гастритах со сниженной секреторной функцией. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приемом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезимфорте и др.).

Известно, что трипсин и химотрипсин практически не атакуют живые клетки, а легко расщепляют белки мертвых клеток. На этом основано их применение для очистки гнойных и некротических ран, лечения сильных ожогов, отморожений, пролежней, гангренозных поражений на почве диабета и атеросклероза, гнойных заболеваний мочевого пузыря и др. Наряду с наружным применением оба фермента стали использовать, вводя их в плевру (в бронхи) аэрозольным способом при лечении эмфизем легких, гематом грудной полости.

Дезоксирибонуклеазу, гидролизующую ДНК вирусов и бактерий, используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитах, а также для ингаляций в виде аэрозолей при гнойном бронхите, бронхиальной астме, абсцессах легких.

Ферментные препараты стали широко применяться при тромбозах и тромбоэмболиях для разрушения тромба. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

Гиалуронидаза (лидаза) гидролизует компонент межклеточного матрикса — гиалуроновую кислоту, повышая проницаемость ткани и сосудистых стенок. Она широко применяется вместе с препаратами для местной анестезии, ускоряя действие и снижая расход анестезирующего вещества, а также используют подкожно и внутримышечно для рассасывания спаек и рубцов после ожогов и операций.

Ферменты используют и в онкологии, например, для замедления развития лейкозов. Известно, что в лейкозных клетках отсутствует фермент, катализирующий синтез аспарагина. Они получают эту аминокислоту из крови. Внутривенное введение фермента аспарагиназы, катализирующего гидролиз аспарагина (рис. 2.38), снижает его концентрацию в крови, тем самым ограничивает поступление аминокислоты в опухолевые клетки При этом в лейкозных клетках на фоне дефицита аспарагина замедляется синтез белков, приводящий к нарушению метаболизма этих клеток, а соответственно и их рост. Развитие нанотехнологий, разработка методов нанокапсулирования ферментов и их направленной доставки к органам-мишеням (включая опухоли) существенно повысят эффективность энзимотерапии различных заболеваний.

Рис. 2.38. Реакция гидролиза аспарагина аспарагиназой