Использование пцр в диагностике инфекционных болезней

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых
сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы
исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом
ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но
и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда
предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для
диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы
специальных лабораторных методов исследования:

1. бактериологические;
2. серологические;
3. метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или
   РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом
   материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии
инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести
бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях
решающее значение имеют данные серологических исследований, в
третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР.
Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту
необходимо использовать данные различных методов лабораторных
исследований.

Бактериологические методы
исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при
подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60%
в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики,
изучения этиологической структуры, определения чувствительности
возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты
бактериологических анализов способствуют выбору наиболее
эффективного препарата для антибактериальной терапии,
своевременному проведению мероприятий для профилактики
внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются
истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные
микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека
или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в
большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания
у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы
вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным
иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых
условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех
микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что
существенно отличает их от аналогичных исследований при
заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда
проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического
исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно
соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его
транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его
результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных
заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным
препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс
методов. Они включают:

• микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из
  доставленного биоматериала;
• выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
• идентификацию бактерий;
• определение чувствительности к антимикробным препаратам и
  оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал
первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка
(бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими
красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого
из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева,
носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют
ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном
содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в
биологическом материале, а также дает предварительную информации об
обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном
биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение
(эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить
микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании
данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания
микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев
исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью
выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и
определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для
этих целей используют различные питательные среды, позволяющие
выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными
являются питательные среды, содержащие кровь животного или
человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов.
Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и
селективные (предназначенные для определенного вида
микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки
Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для
роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных
по Граму

1 — стрептококки; 
2 — стафилококки;  3 — диплобактерии
Фридленда;  4 — пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных
температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для
выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием
кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри
просматривают. Количественную обсемененность доставленного
биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих
единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре
чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды,
ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий
образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые
окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают
мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность
бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений,
капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся
эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и
получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные
среды, оптимальные для культивирования определенного вида
бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают
дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на
морфологических, ферментативных, биологических свойствах и
антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего
вида или варианта.

Идентификация  — это комплекс
бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий
определить вид микроорганизма. В Лаборатории «Ситилаб»
идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на
автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием
диагностических панелей зарубежного производства. На бланке
результата исследования в виде наименования микроорганизма или его
рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или
Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным
препаратам.  Чувствительность к антимикробным
препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов
имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в
направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз
заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к
спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать
препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной
чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется
на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием
диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру
современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в
зависимости от выделенного микроорганизма) с определением
минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов
определения чувствительности к антибактериальным препаратам
обозначение R — указывает на резистентность, I — умеренную
чувствительность, S — чувствительность микроорганизма к данному
препарату.

Оценка результатов исследования. 
Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной
микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их
этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний.
Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную
микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из
окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов
бактериологических исследований необходимо знать состав
естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда
исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например,
спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него
микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех
случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору,
как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать
изменения ее качественного и количественного состава, появление
несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность
биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании
мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и
выше 105, свидетельствует об инфекции мочевых путей.
Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и
является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой
мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры
помогают также нарастание количества и повторность выделения
бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат
бактериологического исследования в отношении биологического
материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь,
плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или
ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий
по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы
исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие
антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух
направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови
обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело,
антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка
реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный
результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител,
гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат
указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают
при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале
заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается
наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь
четырехкратное и большее повышение титра антител во второй
сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного
анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела,
относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что
существенным образом повысило информативность серологических
методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная
система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый
раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к
иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после
попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться
антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на
инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA),
которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и
слизистых оболочек.

2. Установление родовой и видовой
принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным
компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует
постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью
и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний,
могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к
антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты
серологических исследований необходимо с большой осторожностью и
учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено
использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а
также применение метода Western-blot для подтверждения результатов
скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований
связан с разработкой тест-систем для определения авидности
специфических антител к возбудителям различных инфекционных
заболеваний.

Авидность — характеристика прочности связи
специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе
иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента
стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала
специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические
IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то
есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного
процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в
сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных)
IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими
антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа
организма в настоящее время разработаны тест-системы для
определения авидности специфических IgG-антител при различных
инфекционных заболеваниях. Высокая авидность специфических
IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и
тем самым с помощью серологических методов установить период
инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое
распространение нашло определение авидности антител класса IgG при
токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает
дополнительную информацию, полезную в диагностическом и
прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности
при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной
реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов
ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого
участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с
использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический
для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно
умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.
Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется
на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров
(последовательность нуклеотидов специфична для определяемого
генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК,
синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым
праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается
две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики
достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной
частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на
молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило
тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР — это
трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг
праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество
ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или
электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал —
сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная
или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют
для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты
В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания,
передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная,
уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед
другими методами исследований заключается в следующем:

• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической
  среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних
  стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований
  (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом
  материале);
• высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР
  для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл
  (приблизительно 4,0.102 копий/мл), в то время
  как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов —
  2,1 пг/мл (приблизительно 7,0.105
  копий/мл).