Определение периода болезни с помощью серодиагностики
В защите организма от чужеродных антигенов решающую роль играют иммунологические механизмы, осуществляющиеся антителами и иммунокомпетентными клетками. Основа иммунологических механизмов – специфическая реакция между антителами или лимфоцитами (образовавшихся под воздействием попавшего в организм антигена) и антигена. Главная функция антител – связывание антигена и его дальнейшее выведение из организма.
Однако такие реакции между антителами и антигенами могут происходить и вне организма (in vitro) в присутствии электролита и возможны лишь при наличии комплементарности (структурного сходства, сродства) антигена и антитела.
Имея специфические антитела против определенного антигена можно распознать и выявить его среди других антигенов, а в сыворотке крови антитела против известного антигена.
Реакция антиген-антитело in vitro сопровождается возникновением определенного феномена – агглютинации, преципитации, лизиса.
Таким образом все серологические реакции используются с двумя целями:
1) выявление антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов (для серологической диагностики инфекционных болезней);
2) для выявления неизвестных антигенов по известным стандартным сывороткам, содержащим антитела определенной специфичности (для серологической идентификации возбудителей).
Например, если сыворотка больного реагирует с конкретным микробным антигеном – значит в сыворотке больного есть антитела против данного микроорганизма.
Серологическая диагностика – берут стандартный антиген (диагностикум), представляющий собой инактивированные или живые бактерии, вирусы или же их антигены (компоненты) в изотоническом растворе.
Серологическая идентификация – используют стандартные иммунные сыворотки, которые получают от иммунизированных животных (в крови животных в результате многократной иммунизации возбудителем появляется большое количество антител).
Агглютинация.
Агглютинация – серологическая реакция между антителами (агглютининами) и антигенами (агглютининогенами), размещенными на поверхности бактериальной клетки, а в результате образуется комплекс антиген-антитело (агглютинат).
Механизм агглютинации – под влиянием ионов электролита уменьшается негативный поверхностный заряд бактериальной клетки и следовательно они могут сблизиться на такое расстояние при котором возникает склеивание бактерий.
Макро- и микроскопический вид агглютината:
1) О-агглютинация (соматическая) – мелкозернистая, при микроскопии – бактерии склеиваются полюсами клеток, образуя сеть.
2) Vi-агглютинация (капсульная) – мелкозернистая, при микроскопии — склеивание бактерий происходит всей поверхностью клетки.
3) Н-агглютинация (жгутиковая) – агглютинины взаимодействуют с жгутиками обездвиживая бактерии, при микроскопии – крупнохлопчатая, склеивание бактериальных клеток в области жгутиков.
Реакция агглютинации используется для определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) других инфекционных болезнях, а также при определении возбудителя, выделенного от больного. Эту же реакцию применяют для определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации:к разведениям сыворотки крови больного добавляют взвесь убитых микробов (диагностикум)и через несколько часов инкубации при 37°С отмечают наибольше разведение (титр) сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител.
Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации,применяя диагностические антитела, т.е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К 1 капле диагностической иммунной сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Если появляется хлопьевидный осадок, то реакцию проводят в пробирках с увеличивающимися разведениями диагностической сыворотки, добавлял в каждую дозу сыворотки 2—З капли взвеси возбудителя. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. В контролях (сыворотка, разведенная изотоническим раствором хлорида натрия, или взвесь микробов в том же растворе) осадок в виде хлопьев должен отсутствовать.
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками,из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предложено А.Кастелляни (1902).
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам и гормонам и в некоторых других случаях.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО с помощью РА эритроцитов, используя антитела к группам крови А(II), В(III). Контролем служит сыворотка, не содержащая антител, т.е. АВ(IV) группы крови, антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А(II), В(III); отрицательный контроль не содержит антигенов, т.е. используют эритроциты группы 0 (I).
В реакции агглютинации для определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты всех групп крови.
Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют: патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.
Реакция коагглютинации- разновидность РА: клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к иммуноглобулинам, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Схема постановки реакции агглютинации.
Компоненты | Пробирки | ||||||
6 КС | 7 КД | ||||||
Изотонический раствор NaCl (физиологический раствор) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | — | |
Сыворотка больного в разведении 1:5 (стартовое разведение) | 1 | — | |||||
Разведение | 1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:100 | — |
Диагностикум, капли | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | — |
КС – контроль сыворотки; КД – контроль диагностикума
Титр сыворотки — наибольше разведение сыворотки, при котором произошло образование агглютината, т.е. образовался осадок. Фактически – это разведение сыворотки в последней пробирке, где произошло образование агглютината.
Источник
СЕРОИДЕНТИФИКАЦИЯ | СЕРОИНДИКАЦИЯ | СЕРОДИАГНОСТИКА | |||
От больного исследуемый материал в виде чистой культуры возбудителя | Обнаружение возбудителя в исследуемом материале | Обнаружение наличия и количества антител в сыворотке больного | |||
АГ на поверхности РА | АГ внутри кл., разруш. кл., гаптен РП, РСК | РН РП РИФ РИА ИФА | Много АТ РПГА, РП, РА, РФ, РСК, РИФ, РИА, ИФА, РН | Мало АТ РСК, РН, РИФ, РИА, ИФА | |
АГ токсин РФ, РН | АГ капсид вируса РСК, РТГА, РН | ||||
Неполные АТ РИФ, ИФА, РИА, Р.Кумбса |
В серологических реакциях участвуют два специфических комплементарных по отношению друг к другу компонента: антиген (АГ) и антитело (АТ). Они составляют одну специфическую систему типа «ключ+замок». Поэтому, зная один из ингредиентов, например, АГ, можно определить гомологичное ему AT, и наоборот. Смысл любой серологической реакции – визуализировать взаимодействие АГ и АТ в лабораторных условиях.
Серологические реакции ставят в различных направлениях:
1-сероидентификация — определение вида возбудителя при помощи иммунных диагностических сывороток в объеме метода выделения чистой культуры (микробиологического метода). При постановке реакции в данном направлении от больного выделяется чистая культура неизвестного возбудителя, которая используется в качестве АГ (исследуемого материала). В лаборатории необходимо иметь иммунную диагностическую сыворотку, которую получают путем гипериммунизации лабораторных животных (чаще всего кроликов) убитой микробной клеткой известного вида. То есть, иммунная диагностическая сыворотка содержит в себе известные AT, которые способны вступить в специфическую связь со строго определенным АГ. В зависимости от того, чем представлен видовой АГ (целая микробная клетка, гаптен, часть клетки, экзотоксин, вирус) используются различные серологические реакции.
2 – серодиагностика — определение специфических AT в сыворотке больного при помощи диагностикума (определение напряженности гуморального иммунного ответа). При постановке серологической реакции в направлении серодиагностики от больного в качестве исследуемого материала берется сыворотка крови (AT). В лаборатории должен быть диагностикум. Диагностикум — это стандартная взвесь убитой микробной клетки известного вида (АГ).
3 – сероиндикация — обнаружение возбудителя непосредственно в исследуемом материале от больного при помощи иммунных диагностических сывороток. При постановке серологической реакции в направлении сероиндикации от больного берется исследуемый материал, в составе которого находится предполагаемый возбудитель (АГ). В лаборатории необходимо иметь иммунную диагностическую сыворотку, содержащую специфические известные AT.
Любая серологическая реакция протекает в две фазы:
1 — специфическая фаза — соединение АГ бактерий с AT, содержащимися в иммунной сыворотке (невидимая фаза реакции);
2 — неспецифическая фаза — образование видимогоневооруженным глазом изменения (осадка, кольца, гемолоза и т.д.).
Для диагностики инфекционных заболеваний чаще всего используются следующие реакции: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой гемаг- глютинации (РНГА), реакция преципитации (РП), реакция флокуляции (РФ), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН) экзотоксинов и вирусов.
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
Антиген имеет корпускулярную структуру (целые микробные клетки)
Видовые антигены располагаются на поверхности клетки
Реакция производится в присутствии достаточного количества cпецифи-
Ческих антител (IgM), необходимого для получения феномена склеивания
Сыворотка крови титруется на наличие специфических антител или
Проходит специальную процедуру «истощения»
В реакции используется физиологический раствор как источник ионов
Сероидентификация Серодиагностика
Учет через 24 часа по фено- Учет в течение 3-8 Учет через 24 часа по фено-
Мену агглютинации в раз- минут по феномену мену агглютинации в разве-
Источник