Случная болезнь лошадей инструкция по серологической диагностике

(с изменениями на 27 января 1997 года)

____________________________________________________________________
Документ с изменениями, внесенными:
письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838.
____________________________________________________________________

1. Общие положения

УТВЕРЖДАЮ
Заместитель начальника
Департамента ветеринарии
В.М.Авилов

1.1 Трипаносомозы (су-ауру, случная болезнь) — протозойные болезни животных, протекающие преимущественно хронически.

Су-ауру вызываются Trypanosoma evansi поражает верблюдов, лошадей, ослов, мулов и собак. Заболевание сопровождается анемией, увеличением лимфатических узлов, особенно шейных, отеком головы и нервными явлениями.

Случная болезнь вызывается Trypasoma equiperdum и характеризуется появлением отеков половых органов, язв на коже, парезом и параличом лицевых и крестцовых нервов. Болеют лошади, ослы, мулы.

1.2. Диагноз на трипаносомозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (на случную болезнь — микроскопического, серологического; на су-ауру -микроскопического, биологического, серологического и формалиновой реакции).

1.3. В лаборатории для исследования направляют:

на су-ауру — тонкие мазки крови периферических сосудов (уха, хвоста, венчика) от подозреваемого в заболевании животного или сердце, часть печени, селезенку, лимфатические узлы от павшего. Исследование крови в раздавленной капле можно проводить в хозяйстве: на случную болезнь — соскобы с примесью крови из различных мест слизистой оболочки влагалища, мочеиспускательного канала, сперму, экссудат из надрезов отеков и бляшек.
(Абзац в редакции, введенной в действие письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838.

Соскобы из различных мест слизистой оболочки уретры берут с помощью уретральной ложки. Для этого жеребца фиксируют и вводят внутримышечно в области крупа рометар в дозе 7,5 куб.см на 100 кг массы тела. Через 7-10 мин вводят уретральную ложку на глубину 5-6 см и делает 3-4 возвратно-поступательных движения по стенке уретра. После чего уретральную ложку осторожно извлекают, опускают материал в пробирку физиологического раствора рН 7,0-7,2 и закрывают резиновой пробкой.

Сперму от жеребцов получают на искусственную вагину, переливают в стерильные пробирки по 2 куб.см и закрывают пробками.
(Абзац дополнительно включен письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838)

Соскобы со стенок влагалища берут уретральной ложкой через влагалищное зеркало. Материал осторожно опускают в пробирку с 2 см физиологического раствора рН 7,0-7,2 и закрывают пробкой. Экссудат из надрезов отеков и бляшек собирают шприцем, переносят в пробирку и закрывают пробкой.

Для серологического исследования направляют 1-2 см сыворотки крови, нативной или консервированной 5%-ным раствором фенола (1 капля на 1 см сыворотки) или сухой борной кислотой (2-4% к объему); для биологического — гепаринированную (5 Ед гепарина на 1 куб.см крови) или цитрированную (1 капля 6%-ного водного раствора лимонно-кислого натрия на 1 куб.см крови).

Мазки упаковывают в чистую бумагу, патологический материал во влагонепроницаемую тару.

1.4. Патологический материал доставляют в лабораторию в термосе со льдом не позднее 4 ч, кровь и сыворотку — не позднее 2 дней с момента взятия.

2. Микроскопическое исследование

2.1. При исследовании на месте каплю крови периферических сосудов наносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в раздавленной капле под средним увеличением микроскопа в затемненном поле зрения.

Пробирки с соскобами, экссудатом и спермой помещают в термостат при 37°С на 15-20 мин. Затем берут 3-4 капли из разных слоев содержимого пробирки и готовят препараты, как указано выше.
(Абзац в редакции, введенной в действие письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838.

При микроскопии обнаруживают живых трипаносом по колебанию ундулирующей мембраны.

2.2. Из доставленных соскобов, экссудата, спермы, каждого органа делают по 2 тонких мазка и высушивают на воздухе.
(Абзац в редакции, введенной в действие письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838.

Мазки крови периферических сосудов, из внутренних органов, соскобов экссудата и спермы фиксируют этиловым ректификованным спиртом массовой долей 96% в течение 20-25 мин, окрашивают по Романовскому 30-50 мин (краску Гимза используют в разведении 1:20), промывают дистиллированной или водопроводной водой рН 7,0-7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа.
(Абзац в редакции, введенной в действие письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России от 27 января 1997 года N 13-7-2/838.

При микроскопии необходимо учитывать, что трипаносомы вызывающие су-ауру и случную болезнь, морфологически не дифференцируются, имеют веретенообразную форму, заостренную с переднего и слегка округленную с заднего конца. Цитоплазма трипаносом окрашивается в синевато-фиолетовый цвет, ядро — в красный, кинетопласт и жгутик — в розовый (интенсивность окрашивания зависит от времени окраски, качества краски).

3. Биологическое исследование

3.1. Заражение лабораторных животных проводят в случае получения отрицательных результатов микроскопического исследования на су-ауру и наличии клинических признаков у больного животного, а также при необходимости дифференциации су-ауру от случной болезни.

З.2. Для заражения используют нативную, консервированную кровь или суспензию из паренхиматозных органов.

Кусочки органов массой 1,0-1,5 г измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с 1-2 куб.см физиологического раствора. Для заражения суспензию разводят стерильным физиологическим раствором рН 7,0-7,2 в соотношении 1:10.

3.3. Консервированную или нативную кровь вводят подкожно в области спины или внутриутробно в нижней трети живота, суспензию из паренхиматозных органов — подкожно в дозе 0,4 куб.см 3 белым мышам массой 12-15 г.

З.4. Наблюдение за зараженными белыми мышами ведут в течение 10 дней.

3.5. Гибель белых мышей наступает через 3-4 дня. Из паренхиматозных органов павших животных делают тонкие мазки, окрашивают как указано в п.2.2 и исследуют на наличие возбудителя су-ауру, так как возбудитель случной болезни в организме белой мыши не размножается.

При отсутствии гибели зараженных животных в указанные сроки, от них, начиная с 5 дней после заражения, ежедневно исследует кровь, взятую из хвостовой вены, на наличие возбудителя су-ауру в раздавленной капле или окрашенном препарате.

4. Серологическое исследование

4.1. Исследование сывороток крови лошадей, ослов, мулов и собак проводят в реакции связывания комплемента (РСК), верблюдов — в формалиновой реакции (ФР).

4.2. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

4.2.1. Компоненты реакции и подготовка их к работе.

Компоненты реакции:

— антиген трипаносомный жидкий или лиофилизированный, используют в рабочем разведении, указанном на этикетке;

— комплемент — нативная, консервированная или сухая (изготовленная на биофабрике) сыворотка крови морской свинки. При использовании сухого комплемента содержимое необходимого количества ампул растворяют в физиологическом растворе и сливают в одну пробирку. Полученный раствор комплемента используют для титрования (в разведении 1:20) и главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) с титром не ниже 1:1000, которую используют в реакцию в удвоенном титре. Например, при титре гемолизина 1:1000 его берут в реакцию в разведении 1:500. Гемолизин титруют 1 раз в 3 мес по общепринятой схеме:

испытуемая, трипаносомная и нормальная сыворотки, разведенные для главного опыта и титрования комплемента, инактивируют при 60-62 гр.С (сыворотки ослов, мулов — при 64-65 гр.С) — 30 мин;

— 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 мин до полной прозрачности надосадочной жидкости.

Перед постановкой реакции готовят разведение каждого компонента в соответствии с указаниями на этикетках и в количестве, необходимом для всего опыта, включая титрование.

В процессе работы не допускается дополнительно разводить компоненты, смешивать их с ранее разведенными и использовать в реакции без титрования.

Физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде рН 7,0-7,2 готовят в день постановки реакции и кипятят в течение 5 мин.

Гемолитическую систему готовят путем смешивания равных объемов 2,5%-ной взвеси эритроцитов и гемолизина в удвоенном титре, выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20-30 мин.

4.2.2. Титрование комплемента в гемолитической системе проводят при получении каждой новой серии сухого комплемента или при использовании нативной сыворотки крови морской свинки.

4.2.3. Титрование комплемента в бактериолитической системе проводят перед каждой постановкой реакции на 3 сыворотках: позитивной (трипаносомной), негативной и одной из опыта. Сыворотки, разведенных физиологическим раствором 1:5, инактивируют, как указано в п.4.2.1, и разливают каждую 2 ряда пробирок штатива Флоринского по 0,2 куб.см. Комплемент титруют в разведении 1:20, начиная о дозы 0,02 куб.см и до 0,2 куб.см с интервалом 0,02 куб.см.

Для более точной дозировки рекомендуется приготовить в дополиительном ряду пробирок необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах и аппаратом Флоринского с пипетками объемом 0,2 куб.см перенести разведения комплимента в ряды с сыворотками для титрования.

Порядок внесения компонентов и режим титрования указаны в таблице 1 на примере негативной сыворотки.

Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, вызывающего полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также с трипаносомной сывороткой без антигена, при полной задержке гемолиза в пробирках с трипаносомной сывороткой и антигеном (в таблице 1 титр равен 0,12).

Для главного опыта берут дозу комплемента, полученную при титровании.

4.2.4. Общее количество комплемента для главного опыта определяют по формуле:

,

где Х — количество комплемента для главного опыта;

Т — титр комплемента в бактериологической системе;

П — количество пробирок в опыте;

20 — разведение комплемента при титровании.

Например, в опыте 100 пробирок, титр комплемента 0,12, расчет его на опыт:

куб.см

Необходимое количество разведенного комплемента для реакции равно 20 куб.см (0,2 х 100), следовательно, к 0,6 куб.см основного разведения комплемента нужно добавить 19,4 куб.см физиологического раствора.

4.2.5. Постановка главного опыта.

Реакцию ставят в объеме 1,0 куб.см по 0,2 куб.см каждого компонента.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Для этого в первую пробирку вносят 0,1 куб.см сыворотки и добавляют 0,4 куб.см физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки переносят 0,2 куб.см во вторую и 0,1 куб.см — в третью, куда добавляют 0,1 куб.см физиологического раствора (разведение 1:10) и инактивируют как указано в п.4.2.1.

Таблица 1. Титрование комплемента в бактериологической системе.

Таблица 1

(на примере негативной сыворотки)

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,2 куб.см трипаносомного антигена в рабочем разведении, в пробирки первого ряда — по 0,2 куб.см физиологического раствора, во все пробирки — по 0,2 куб.см комплемента в установленном титре.

Реакцию помещают в водяную баню на 20 мин при 37-38 гр.С, затем, в каждую пробирку вносят по 0,4 куб.см гемолитической системы и вновь выдерживают в бане при том же режиме.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:5, для чего с 0,05 куб.см сыворотки аппаратом Флоринского вносят 0,2 куб.см физиологического раствора. Все сыворотки, давшие положительный или сомнительный результат, подлежат переисследованию в 3 пробирках, как указано выше.

4.2.6. Контроли главного опыта:

позитивная сыворотка в разведениях от 1:5 до ее предельного титра с антигеном и в разведении 1:5 без антигена, негативная — в тех же разведениях, что и испытуемые;

антиген в двойной дозе без сыворотки (на антикомплементарность);

антиген в двойной дозе без сыворотки и комплемента (на гемотоксичность).

4.2.7. Учет и оценка результатов реакции.

Результаты реакции учитывают дважды, сразу после выдержки в водяной бане и на следующий день при хранения реакции в холодильнике.

Сначала учитывают результаты контролей:

в пробирках с положительной сывороткой и антигеном в контроле на гемотоксичность должна быть полная задержка гемолиза;

в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без антигена, с позитивной сывороткой без антигена и в контроле на антикомплементарность — полный гемолиз.

Степень гемолиза выражают в крестах:

Положительной считают реакцию с оценкой на 2-4 креста в разведении 1:5 или 1-4 креста в разведении 1:10.

Сомнительной — 1 крест в разведении 1:5.

Отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в обоих разведениях сыворотки.

4.2.8. Животных, с сывороткой крови которых получены сомнительные результаты в РСК, исследуют повторно через 1 месяц. При получении вторично сомнительных результатов животных считают положительно реагирующими.

4.3. Постановка формалиновой реакции.

4.3.1.Формалиновая реакция не является специфической, но ее постановка допускается для обследования верблюдов.

4.3.2. Компоненты реакции: сыворотка крови верблюда и формалин массовой концентрации 400 куб.см./куб.дм.

4.3.3. Постановка реакции. В чистую сухую пробирку вносят 1 см.куб. сыворотки и 2 капли формалина, встряхивают, закрывают ватной пробкой и выдерживают 2 дня при комнатной температуре.

4.4.4. Учет и оценка результатов реакции:

положительная — сыворотка становится плотной, иногда мутнеет при опрокидывании пробирки не стекает;

сомнительная — сыворотка слегка густеет, стекает с трудом;

отрицательная — сыворотка остается без изменений.

5. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей:

обнаружение трипаносом в мазках из исходного материала или от зараженных животных;

положительный результат серологического исследования;

положительная формалиновая реакция при наличии клинических или эксзоотологических данных.

6. Сроки исследований:

микроскопического — 2 дня,

биологического — 10 дней,

серологического — 4 дня,

формалиновой реакции — 3 дня.

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена
АО «Кодекс»